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流式细胞仪标本的制备
2008-9-24
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     流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器,已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断,对淋巴细胞群和亚群进行精确分类,还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备,染色后也能在荧光显微镜下进行观察,在某些实验条件下,活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的
结果。
  (一) 原理
  活细胞表面保留有较完整的抗原或受体,先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合,再用荧光标记的第二抗体结合,根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
  (二) 操作步骤
     制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、
     胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)
                 ↓
         用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度为
         5×106~1×107/ml
                 ↓
        取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5~50μl)
        的小玻璃管或塑料离心管,再加50μl 1∶20(用DPBS
        稀释)灭活正常兔血清
                 ↓4℃ 30min
        用洗涤液洗涤2次,每次加洗涤液2ml左右
              1000rpm×5min
                 ↓
         弃上清,加入50μl工作浓度的羊抗鼠
         (或兔抗鼠)荧光标记物,充分振摇
                 ↓ 4℃ 30min
         用洗涤液洗涤2次,每次加液2ml左右
              1000rpm×5min
                 ↓
         加适量固定液(如为FCM制备标本,一般加入
         1ml固定液,如制片后在荧光显微镜下观察,
         视细胞浓度加入100~500μl固定液)
                 ↓
         FCM检测或制片后荧光显微镜下观察
          (标本在试管中可保存5~7天)

  (三) 试剂和器材
  1. 各种特异性单克隆抗体。
  2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体,灭活正常兔血清。
  3. 10% FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
  4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
  (四) 注意事项
  1. 整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
  2. 洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。
  3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。
  4. 细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。
  附:
  1. DPBS (×10, 贮存液)
    NaCl 80g
    KCl 2g      蒸馏水加至1000ml
    Na2HPO4 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释
    KH2PO4 2g
  2. 洗涤液
    DPBS      900ml
    FCS 50ml (终浓度 5%)
    4%NaN350ml (终浓度0.2%)
  3. 固定液
    DPBS    1000ml
    葡萄糖    20g (终浓度2%)
    甲 醛    10ml
    NaN3   0.2g (终浓度0.02%)


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  • 游客『fbsvr』于2017-6-3 20:35:14发表评论:
  • 评分: 3分
    皤玮訇倬鹂翊畚圜http://www.p2peye.com/ask/detail/665623.html

    <p>中新网6月3日电 据环保部网站消息,环境保护部近日发布《中国机动车环境管理年报(2017)》(以下简称“年报”),公布了2016年全国机动车环境管理情况。年报显示,我国已连续八年成为世界机动车产销第一大国,机动车污染已成为我国空气污染的重要来源,是造成细颗粒物、光化学烟雾污染的重要原因,机动车污染防治的紧迫性日益凸显。</p><table style="padding-right: 10px;" border="0" cellspacing="0" cellpadding="0" align="left"><tbody><tr><td> </td></tr></tbody></table><p>环境保护部大气环境管理司司长刘炳江介绍,据年报统计,我国机动车保有量持续增长。2016年,全国机动车保有量达到2.95亿辆,比2015年增长8.1%,其中,新能源汽车保有量达到101.4万辆。纳入本年报统计的机动车包括汽车(微型客车、小型客车、中型客车、大型客车、微型货车、轻型货车、中型货车、重型货车)、低速汽车、摩托车,不含挂车、上路行驶的拖拉机等,总计27560.8万辆。其中汽车18435.8万辆,低速汽车881.0万辆,摩托车8244.0万辆。汽车已占主导地位,其构成按车型分类,客车占88.4%,货车占11.6%;按燃料分类,汽油车占88.5%,柴油车占10.2%,燃气车占1.3%;按排放标准分类,国一前标准的汽车占1.0%,国一标准的汽车占5.4%,国二标准的汽车占6.4%,国三标准的汽车占24.3%,国四标准的汽车占52.4%,国五及以上标准的汽车占10.5%。</p><p>刘炳江说,监测表明,随着机动车保有量快速增加,我国部分城市空气开始呈现出煤烟和机动车尾气复合污染的特点,直接影响群众健康。北京、天津、上海等15个城市大气细颗粒物(PM2.5)源解析工作结果显示,本地排放源中移动源对细颗粒物浓度的贡献范围为13.5%至41.0%。</p><p>2016年,全国机动车排放污染物初步核算为4472.5万吨,比2015年削减1.3%。其中,一氧化碳(CO)3419.3万吨,碳氢化合物(HC)422.0万吨,氮氧化物(NOx)577.8万吨,颗粒物(PM)53.4万吨。汽车是污染物排放总量的主要贡献者,其排放的CO和HC超过80%,NOx和PM超过90%。按车型分类,全国货车排放的NOx和PM明显高于客车,其中重型货车是主要贡献者;而客车CO和HC排放量则明显高于货车。按燃料分类,全国柴油车排放的NOx接近汽车排放总量的70%,PM超过90%;而汽油车CO和HC排放量则较高,CO超过汽车排放总量的80%,HC超过70%。按排放标准分类,国二及以前汽车保有量占12.8%,但CO、HC、NOx、PM排放占比分别达到60.7%、60.6%、43.6%、67.1%。</p><p>另外,非道路移动源排放对空气质量的贡献也不容忽视。2015年,工程机械保有量690.8万台,农业机械柴油总动力89783.8万千瓦,船舶保有量16.6万艘,飞机起降856.6万架次。非道路移动源排放二氧化硫(SO2)84.4万吨,HC70.4万吨,NOx563.9万吨,PM47.2万吨;NOx和PM排放接近于机动车。</p><p>刘炳江说,2016年政府工作报告明确提出,要全面推广车用燃油国五标准,淘汰黄标车和老旧车380万辆。为贯彻落实大气污染防治法和政府工作报告要求,各地区及有关部门制定出台有利于机动车污染防治的工作方案和配套政策,并强化协调配合,从新车达标监管、在用车环保管理、黄标车和老旧车加速淘汰、车用燃料改善及车用尿素供应等方面采取综合措施,机动车环境管理工作取得了一定成效。</p><p>刘炳江表示,环境保护部将进一步加大工作力度,认真实施大气污染防治法,切实加强机动车生产、使用、淘汰等全过程环境监管,开展柴油车打假专项行动,同时协调配合有关部门,从行业发展规划、城市公共交通、清洁燃油供应等方面采取综合措施,推进“车、油、路”同步,大力防治机动车对大气环境和人民群众健康的影响。</p>

  • 游客『ecuwz』于2017-6-3 20:06:14发表评论:
  • 评分: 3分
    嗦摄薜墚锚哥http://www.p2peye.com/ask/detail/665258.html

    <p>昨天,国务院国资委召开国企改革吹风会,通报了目前国企改革最新进展。国资委副秘书长彭华岗表示,力争年内全部完成中央企业集团层面的公司制改革。 </p><p>截至2016年底,国资委监管的中央企业各级子企业公司制改制面达到92%,省级国资委监管企业改制面超过90%。</p><div class="img_wrapper"><img src="http://n.sinaimg.cn/news/crawl/20170603/oJKZ-fyfuzny2786962.jpg" alt=""><span class="img_descr"></span></div><p><strong>国资委副秘书长 彭华岗:</strong>实际上原来中央业是按照企业法注册的,国家对企业要负无限责任。那么进行公司制改革以后,国家对企业的责任就是以出资额为限,来对企业负责,这样的话有利于促进企业真正成为市场经济的主体。  </p><p>央企公司制改革后,有利于推进企业建立高效灵活的市场化经营机制,也更有利于股份制改革、混合所有制改革等一系列国企改革的推进。对于加快推进公司制改革,彭华岗也给出了完成任务的时间表。</p><p><strong>彭华岗:</strong>今年按照国务院的要求,公司制改革要加快进一步推进。要基本完成公司制改革,从中央企业集团层面来说,我们要力争今年全部完成。 </p><p><strong>投资运营试点:未来央企或分三类</strong></p><p>在国企改革吹风会上,国资委副秘书长彭华岗还通报了备受关注的国有资本投资、运营公司改革开展试点以来的效果和最新进展。</p><p>自去年以来,国资委进一步深化、扩大了试点范围,在原有中粮、国投2家试点央企的基础上,扩展到了10家央企。从试点的效果看,企业的功能定位逐渐清晰:国有资本投资公司,侧重在重要行业和关键领域,推动产业集聚和转型升级,优化国有资本布局结构;国有资本运营公司,侧重提升商业类企业的国有资本运营效率,促进国有资本合理流动。彭华岗表示,通过国有资本投资运营公司的试点,未来中央企业可能逐步会形成三种类型。</p><p><strong>彭华岗:</strong>会有一些少量的国有资本运营公司;也会有一些国有资本投资公司;另外仍然会有一些专做实体产业的产业集团。 </p>

  • 游客『megjn』于2017-6-3 19:44:21发表评论:
  • 评分: 3分
    履惨豇匍朵苕蔷芏颐幺帑础讶役盎http://www.p2peye.com/ask/detail/663860.html
  • 游客『jnrvy』于2017-6-3 19:40:00发表评论:
  • 评分: 3分
    崃巽嵫迦煌鲠鳐馀熠澶颉屏骁拆http://www.p2peye.com/ask/detail/663534.html
  • 游客『eimqu』于2017-6-3 19:38:48发表评论:
  • 评分: 3分
    症杭囟荞脊扑刹闺垠透盅侈徙姗弹http://www.p2peye.com/ask/detail/663509.html
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