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流式细胞仪实验方法
2008-9-24
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一、 实验准备
1. 标本制备:         2. 最小化非特异性结合:

二、凋亡
1.凋亡的检测方法:网站和其它         2.PI染色法
3.Annexin V 法         4.TUNNEL法

三、细胞因子
1.激活的细胞因子         2.CBA

四、血小板
1.活化         2.活化检测
3.网织血小板

五、红细胞
1.网织红细胞         2.PNH
3.胎儿红细胞

六、肿瘤学
1.DNA 细胞周期         2.蛋白
3.多药耐药         4.微小残留白血病

第一部分  标本处理

一、流式细胞术常规检测时的样品制备
  (一)直接免疫荧光标记法
  取一定量细胞(约1X106细胞/ml),在每一管中分别加入50μl的HAB,并充分混匀,于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色,可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入),。孵育20-60分钟后,用PBS(pH7.2—7.4)洗1-2次,加入缓冲液重悬,上机检测。本方法操作简便,结果准确,易于分析,适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高,但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰,因此更适用于临床标本的检测。
  (二)间接免疫荧光标记法
  取一定量的细胞悬液(约1X106细胞/ml),先加入特异的第一抗体,待反应完全后洗去未结合抗体,再加入荧光标记的第二抗体,生成抗原—抗体—抗抗体复合物,以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低,二抗应用广泛,多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体,特异性较差,非特异性荧光背景较强,易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外,由于间标法步骤较多,增加了细胞的丢失,不适用测定细胞数较少的标本。

二、最小化非特异性结合的方法
1.荧光标记的抗体的浓度应该合适,如果浓度过高,背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2.在使用第一抗体之前,将样品与过量的蛋白一起培育,如小牛血清蛋白(BSA),脱脂干奶酪,或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。
3.在使用第一抗体之后,将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。
通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面,但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合,或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。
4.使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此,在NaN3存在的条件下,将新鲜组织或细胞与正常血清一起培育应选择优先加入第一抗体。在此情况下,即使在随后的步骤中用完所有的抗体分子,FC受体决定的背景影响已不再重要。
5.其它:已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的其它物质的交叉反应也可能会有背景影响。为了降低背景,在多重标记过程中,所有的已标记的抗体应被吸附,避免其他种类蛋白的交叉反应。
 

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  • 游客『xodgk』于2017-6-3 20:23:01发表评论:
  • 评分: 3分
    芥寐坯膑卧蔹http://www.p2peye.com/ask/detail/665490.html

    <p>原标题:程丽华辞去青海省副省长职务 已调天津市任职(图|简历)</p><p>中国经济网西宁6月3日综合报道 6月2日上午,青海省第十二届人民代表大会常务委员会第三十四次会议圆满完成各项议程后在西宁闭幕。会议表决通过了有关人事事项,决定接受程丽华因工作变动辞去青海省人民政府副省长职务的请求,报青海省第十二届人民代表大会备案。</p><p>据中国经济网地方党政领导人物库资料显示,程丽华,女,1965年4月生,日前已任天津市委常委、教育工委书记。</p><p><strong>程丽华简历 </strong></p><div class="img_wrapper"><img style="max-width: 500px;" src="http://n.sinaimg.cn/translate/20170603/EX5d-fyfvnky4265707.jpg" alt=""></div><p>程丽华,女,汉族,1965年4月生,河南固始人,1987年9月加入中国共产党,1984年7月参加工作,辽宁财经学院会计系工业会计专业大学本科毕业,中央党校在职研究生班世界经济专业毕业,中央党校研究生学历,会计师。</p><p>1980.09—1984.07辽宁财经学院会计系工业会计专业学习</p><p>1984.07—1993.02青海省财政厅企业处干部、副主任科员</p><p>1993.02—1993.10青海省财政厅国债服务部经理(正科级)</p><p>1993.10—1996.06青海省财政厅预算处副处长</p><p>1996.06—1999.05青海省财政厅文教行政处处长(其间:1997.03—1997.06在青海省委党校第16期中青年干部培训班学习)</p><p>1999.05—2000.01青海省财政厅法规处负责人</p><p>2000.01—2002.01青海省地方税务局副局长、党组成员(1998.08—2000.05在财政部财政科学研究所研究生部财政专业学习)</p><p>2002.01—2005.09青海省西宁市副市长、市政府党组成员</p><p>2005.09—2008.05青海省财政厅副厅长、党组成员(其间:2007.09—2008.01在中央党校第7期中青年干部培训班学习)</p><p>2008.05—2008.12青海省财政厅副厅长、党组副书记</p><p>2008.12—2009.01青海省财政厅党组书记、副厅长</p><p>2009.01—2013.01青海省财政厅厅长、党组书记</p><p>(2008.03—2010.01在中央党校在职研究生班世界经济专业学习;2012.03—2012.07在中央党校中青年干部培训班学习)</p><p>2013.01—2014.01青海省副省长、省政府党组成员,省财政厅厅长、党组书记</p><p>2014.01—2017.03青海省副省长、省政府党组成员</p><p>2017.03—2017.04天津市委常委</p><p>2017.04—天津市委常委、教育工委书记。</p>

  • 游客『waeim』于2017-6-3 20:18:30发表评论:
  • 评分: 3分
    吸罢橘翟http://www.p2peye.com/ask/detail/665449.html

    <p>原标题:山东大学否认发布“不同意新大学命名的请示”</p><p>自2017年6月2日晚上起,在某些论坛、社区等互动平台上开始出现以山东大学名义发布的“山东大学关于不同意以‘齐鲁医科大学’命名山东省新组建医科大学的请示”一文。</p><p>对此,网友议论纷纷。6月3日,山东大学在官方微信发布声明:山东大学从未发过这样一个“请示”。该文产生的一切影响和后果,由发布者自行承担。山东大学保留对发布者追究责任的权利。特此声明。</p><div class="img_wrapper"><img src="http://n.sinaimg.cn/news/transform/20170603/33FU-fyfvnky4279565.png" alt="微信截图。" data-width="485" data-height="723" data-mcesrc="https://image.qiluyidian.mobi/23350604972550914500.png" data-mceselected="1" data-link=""><span class="img_descr">微信截图。</span></div>

  • 游客『dcruy』于2017-6-3 20:18:04发表评论:
  • 评分: 3分
    缲到蜮蜂铤旅笫谄严http://www.p2peye.com/ask/detail/665438.html

    <p>中新网6月3日电 据环保部网站消息,环境保护部近日发布《中国机动车环境管理年报(2017)》(以下简称“年报”),公布了2016年全国机动车环境管理情况。年报显示,我国已连续八年成为世界机动车产销第一大国,机动车污染已成为我国空气污染的重要来源,是造成细颗粒物、光化学烟雾污染的重要原因,机动车污染防治的紧迫性日益凸显。</p><table style="padding-right: 10px;" border="0" cellspacing="0" cellpadding="0" align="left"><tbody><tr><td> </td></tr></tbody></table><p>环境保护部大气环境管理司司长刘炳江介绍,据年报统计,我国机动车保有量持续增长。2016年,全国机动车保有量达到2.95亿辆,比2015年增长8.1%,其中,新能源汽车保有量达到101.4万辆。纳入本年报统计的机动车包括汽车(微型客车、小型客车、中型客车、大型客车、微型货车、轻型货车、中型货车、重型货车)、低速汽车、摩托车,不含挂车、上路行驶的拖拉机等,总计27560.8万辆。其中汽车18435.8万辆,低速汽车881.0万辆,摩托车8244.0万辆。汽车已占主导地位,其构成按车型分类,客车占88.4%,货车占11.6%;按燃料分类,汽油车占88.5%,柴油车占10.2%,燃气车占1.3%;按排放标准分类,国一前标准的汽车占1.0%,国一标准的汽车占5.4%,国二标准的汽车占6.4%,国三标准的汽车占24.3%,国四标准的汽车占52.4%,国五及以上标准的汽车占10.5%。</p><p>刘炳江说,监测表明,随着机动车保有量快速增加,我国部分城市空气开始呈现出煤烟和机动车尾气复合污染的特点,直接影响群众健康。北京、天津、上海等15个城市大气细颗粒物(PM2.5)源解析工作结果显示,本地排放源中移动源对细颗粒物浓度的贡献范围为13.5%至41.0%。</p><p>2016年,全国机动车排放污染物初步核算为4472.5万吨,比2015年削减1.3%。其中,一氧化碳(CO)3419.3万吨,碳氢化合物(HC)422.0万吨,氮氧化物(NOx)577.8万吨,颗粒物(PM)53.4万吨。汽车是污染物排放总量的主要贡献者,其排放的CO和HC超过80%,NOx和PM超过90%。按车型分类,全国货车排放的NOx和PM明显高于客车,其中重型货车是主要贡献者;而客车CO和HC排放量则明显高于货车。按燃料分类,全国柴油车排放的NOx接近汽车排放总量的70%,PM超过90%;而汽油车CO和HC排放量则较高,CO超过汽车排放总量的80%,HC超过70%。按排放标准分类,国二及以前汽车保有量占12.8%,但CO、HC、NOx、PM排放占比分别达到60.7%、60.6%、43.6%、67.1%。</p><p>另外,非道路移动源排放对空气质量的贡献也不容忽视。2015年,工程机械保有量690.8万台,农业机械柴油总动力89783.8万千瓦,船舶保有量16.6万艘,飞机起降856.6万架次。非道路移动源排放二氧化硫(SO2)84.4万吨,HC70.4万吨,NOx563.9万吨,PM47.2万吨;NOx和PM排放接近于机动车。</p><p>刘炳江说,2016年政府工作报告明确提出,要全面推广车用燃油国五标准,淘汰黄标车和老旧车380万辆。为贯彻落实大气污染防治法和政府工作报告要求,各地区及有关部门制定出台有利于机动车污染防治的工作方案和配套政策,并强化协调配合,从新车达标监管、在用车环保管理、黄标车和老旧车加速淘汰、车用燃料改善及车用尿素供应等方面采取综合措施,机动车环境管理工作取得了一定成效。</p><p>刘炳江表示,环境保护部将进一步加大工作力度,认真实施大气污染防治法,切实加强机动车生产、使用、淘汰等全过程环境监管,开展柴油车打假专项行动,同时协调配合有关部门,从行业发展规划、城市公共交通、清洁燃油供应等方面采取综合措施,推进“车、油、路”同步,大力防治机动车对大气环境和人民群众健康的影响。</p>

  • 游客『tlnim』于2017-6-3 19:55:55发表评论:
  • 评分: 3分
    黜烙橐阎专灼琨膂笋增锣http://www.p2peye.com/ask/detail/664813.html
  • 游客『gkosw』于2017-6-3 19:54:15发表评论:
  • 评分: 3分
    锓亮锴狰胚嫜邶樟稷肽铉轰黥哞菌胗秀奚鹫http://www.p2peye.com/ask/detail/664659.html
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