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增加PCR特异性
2008-9-24
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1、引物设计

    细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点:
1.典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。
2.选择GC含量为40%到60%或GC含量映像模板GC含量的引物。
3.设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。
4.避免引物对3'末端存在互补序列,这会形成引物二聚体,抑制扩增。
5.避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。
6.避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
7.避免存在可能会产生内部二级结构的序列,这会破坏引物退火稳定性。
目的序列上并不存在的附加序列,如限制位点和启动子序列,可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列,但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。
有时候,对于引物设计仅了解有限的序列信息。比如,如果仅知道氨基酸序列,可以设计兼并引物。兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性,可以参考密码子使用表,根据不同生物的碱基使用偏好,减少兼并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对,降低引物的退火温度。不要在引物的3'端使用兼并碱基,因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度(1μM到3μM),因为许多兼并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。

2、引物退火温度

    引物的另一个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
    设定Tm有几种公式。表4列出确定引物Tm最常用的两种方法。第一个公式来源于高盐溶液中的杂交,适用于小于18碱基的引物。第二个公式根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。
    根据所使用的公式及引物序列的不同,Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值,所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃,以2℃为增量,逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果,两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃,就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同,将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环,然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

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  • 游客『tyaei』于2017-6-3 20:02:27发表评论:
  • 评分: 3分
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  • 游客『hmosw』于2017-6-3 20:00:20发表评论:
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    <p>原标题:江苏人陈刚履新河北省委常委 又任雄安新区临时党委书记</p><div class="img_wrapper"><img src="http://n.sinaimg.cn/news/transform/20170603/XK_u-fyfuzpn3322789.jpg" alt="" data-link=""><span class="img_descr"></span></div><p>6月2日,河北省委常委、雄安新区临时党委书记陈刚在雄安新区调研,先后到容城县、雄县部分企业、村庄、社区了解管控工作情况、群众生产生活和产业发展情况,到宋辽古战道调研文化遗产、文物等保护工作,到安新县白洋淀察看生态环境保护情况,就做好下一步规划建设工作提出明确要求。</p><p>陈刚指出,设立雄安新区,是以习近平同志为核心的党中央作出的一项重大的历史性战略选择,是继深圳经济特区和上海浦东新区之后的又一具有全国意义的新区,是千年大计、国家大事。要深入学习贯彻习近平总书记系列重要讲话和重要指示批示精神,夙兴夜寐、激情工作,全力以赴做好雄安新区的各项工作。</p><p>陈刚强调,要加速推进服装等传统特色产业转型升级,走高端、集约发展之路,形成产业竞争力。要加强基层党组织建设,整顿软弱涣散基层党组织,建强村党组织书记队伍,深入做好群众工作,真正发挥基层党组织战斗堡垒作用。要继续加强规划、土地和房地产等管控工作,保护传承好历史文化遗产,保持社会大局稳定,为雄安新区规划建设开好局、起好步创造有利条件。要坚持生态优先、绿色发展,加强生态建设,开发地热等绿色能源,加大造林和湿地恢复力度,构建蓝绿交织、清新明亮、水城共融的生态城市。</p><p> <strong> 陈刚简历</strong></p><p>陈刚,男,汉族,1965年4月生,江苏高邮人,1986年12月入党,1990年8月参加工作,研究生学历,理学博士学位,教授级高级工程师职称。</p><p>1980.09扬州师范学院化学系学习</p><p>1984.09 哈尔滨工业大学应用化学系高分子材料专业硕士研究生学习</p><p>1987.09 北京大学化学系无机化学专业博士研究生学习</p><p>1990.08 北京玻璃研究所晶体室工程师、副主任</p><p>1994.05 北京玻璃研究所副所长</p><p>1994.07 北京一轻集团有限责任公司副总经理兼北京玻璃研究院副院长</p><p>2000.07 北京市外经贸委工委委员、副主任</p><p>2002.03 中国贸促会北京市分会党组书记、主任</p><p>2003.01 北京市朝阳区委副书记、副区长、代区长</p><p>2004.01 北京市朝阳区委副书记、区长</p><p>2006.10 北京市朝阳区委书记(其间:2009.03-2009.07中央党校中青班学习)</p><p>2012.07 北京市委常委</p><p>2013.06 贵州省委常委</p><p>2013.07 贵州省委常委,贵阳市委书记,贵阳警备区党委第一书记</p><p>2014.10 贵州省委常委,贵阳市委书记,贵阳警备区党委第一书记,贵州双龙临空经济区党工委书记(兼)</p><p>2015.11 贵州省委常委,贵阳市委书记,贵阳警备区党委第一书记,贵州陆军预备役步兵师第一政治委员,贵州双龙临空经济区党工委书记(兼)</p><p>2017.05 河北省委常委</p><p>十一届、十二届贵州省委委员。(人民网资料 截至2017年5月)</p><p>来源: 河北日报</p>

  • 游客『koswa』于2017-6-3 19:59:30发表评论:
  • 评分: 3分
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  • 游客『vafhl』于2017-6-3 19:55:20发表评论:
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  • 游客『rvzdh』于2017-6-3 19:53:45发表评论:
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