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PCR反应体系与反应条件
2008-9-24
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  PCR反应五要素: 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

  引物: 引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则:
①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。
②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶  核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量: 每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物 量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。


  酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。


  dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装, -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。


  模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是: 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质
结合而沉淀; 蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,
要防止RNase降解RNA。

  Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。


PCR反应条件的选择
  PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

  温度与时间的设置: 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40 ~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延
伸。对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
  ①变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下,93℃~94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失
败。
  ②退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度
、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:
     Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)
     复性温度=Tm值-(5~10℃)
  在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30~60sec,足以使引物与模板之间完全结合。


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  • 游客『ehjmp』于2017-6-3 19:54:53发表评论:
  • 评分: 3分
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  • 游客『cglnr』于2017-6-3 19:45:44发表评论:
  • 评分: 3分
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    <p>中国天气网讯 今明天(3-4日),北京天气以晴到多云为主,适宜出行及户外活动,但午后较热,最高气温将在28-31℃,紫外线照射强,出门还需注意补水防晒。下周一和周二,北京将再迎降雨,最高气温将降至21℃。</p><div class="img_wrapper"><img style="max-width: 500px;" src="http://n.sinaimg.cn/translate/20170603/XUZU-fyfuzpn3304585.jpg" alt="6月3日早晨,北京天空晴朗。"><span class="img_descr">6月3日早晨,北京天空晴朗。</span></div><p>昨天早晨,北京天空云量较多,上午部分地区有降雨出现,不过雨量不大,且分布不均。北京市气象台发布2日1-11时降水量,全市平均0.4毫米,城区平均0.1毫米,东北0.9毫米,东南0.4毫米,西北0.3毫米,西南微量,最大通州于家务3.9毫米。</p><p>受阴雨天气影响,昨天北京城区的最高气温仅为21℃,伴随3-4级风,体感凉爽舒适。</p><p>今天开始,晴热再度回归。北京市气象台预计,今天白天晴间多云,北风1、2级转南风4级左右,最高气温28℃;夜间晴间多云,南转北风1、2级,最低气温16℃。</p><div class="img_wrapper"><img style="max-width: 500px;" src="http://n.sinaimg.cn/translate/20170603/O9DP-fyfuzny2763963.jpg" alt=""><span class="img_descr"></span></div><p>今早5时30分更新的未来7天天气预报显示,明天的天气依然热力十足,白天最高气温将达31℃,外出游玩还需注意防暑降温。到了下周初,北京将有小雨,气温回落明显,下周二的最高气温将仅为21℃。</p><p>目前,北京已进入汛期,天气形势复杂多变,公众可及时关注临近预报预警信息,提前做好防范。</p>

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  • 游客『swaei』于2017-6-3 19:15:21发表评论:
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  • 游客『hlqsw』于2017-6-3 19:10:08发表评论:
  • 评分: 3分
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