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分子生物学实验基础知识
2008-9-24
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      分子生物学是在生物化学基础上发展起来的,以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科,在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程(基因技术,基因重组)是目前分子生物学研究热点,这些技术可以改造或扩增基因和基因产物,使微量的研究对象达到分析水平,是研究基因调控和表达的方法,也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化(transformation)、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式,也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆(gene clone),基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化,得以增量,便于分析。
  外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化(transformation),以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染(transfection)。利用载体(噬菌体或病毒)把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导(transduction)。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位(transposition),这些游动的基因叫转位子。
  一、基因工程的常用工具
  (一)载体
  载体(Vector)是把外源DNA(目的基因)导入宿主细胞,使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒(plasmid)、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒(粘粒)、病毒等。载体具有能自我复制;有可选择的,便于筛选、鉴定的遗传标记;有供外源DNA插入的位点;本身体积小等特征。
  质粒存在于多种细菌,是染色体(核)以外的独立遗传因子,由双链环状DNA组成,几乎完全裸露,很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制,一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制,一个细胞可复制30-50个质粒,如果用氯霉素可阻止蛋白质合成,使质粒有效利用原料,复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多,常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因,如复制起动区(复制原点Ori),便于复制扩增;抗抗生素标记(抗氨芐青霉素Apr、抗四环素Tcr等)或大肠埃希菌部分乳糖操纵子(E.coli LacZ)等,便于基因重组体的筛选;基因发动子(乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等)和转录终止序列,便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点,即基因插入位点,又叫基因重组位点,基因克隆位点。
  常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统;双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点,便于选择,灵活应用。
  (二)工具酶
  工具酶是基因重组技术不可缺少的工具。主要有限制性内切酶、连接酶、核酸聚合酶、逆转录酶、核酸酶等。
  限制性内切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA内切酶之分,Ⅱ型能严格识别核酸序列,并在识别区内特定的核苷酸处切开DNA双链。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA内切酶。识别分四核苷酸和六核苷酸,其序列旋转对称。切口分开端和粘端,产生3′-OH和5′-P末端。内切酶品种多,使用时应注意温度、缓冲液用量(一般1μg DNA/2-5单位酶)等反应条件。


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  • 游客『imquy』于2017-6-3 20:31:36发表评论:
  • 评分: 3分
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    <p>原标题:云南贡山暴雨致万人受灾 百余间房屋受损</p><div class="img_wrapper"><img style="max-width: 500px;" src="http://n.sinaimg.cn/translate/20170603/K0nA-fyfvnky4316871.jpg" alt=""><span class="img_descr"></span></div><div class="img_wrapper"><img style="max-width: 500px;" src="http://n.sinaimg.cn/translate/20170603/J5mR-fyfvnky4316878.jpg" alt=""><span class="img_descr"></span></div><p>央视网消息:6月3日,云南怒江州贡山县的最新灾情统计,持续降雨天气已导致当地过万人受灾,疏散转移安置群众482人,100间房屋受损。5月30日至31日,贡山县出现持续暴雨天气,最大降雨量达到96.4毫米,暴雨导致独龙江水位暴涨,突破了历史水位线,部分道路被淹没,6座桥梁被冲毁,部分电力设施受损,11800人受灾,40.4公顷农作物受灾,100多头(只)家畜死亡,暂未出现人员伤亡情况。</p><div class="img_wrapper"><img style="max-width: 500px;" src="http://n.sinaimg.cn/translate/20170603/Hmnc-fyfuzpn3381464.jpg" alt=""><span class="img_descr"></span></div><div class="img_wrapper"><img style="max-width: 500px;" src="http://n.sinaimg.cn/translate/20170603/DSgU-fyfuzmy1537179.jpg" alt=""><span class="img_descr"></span></div><p>灾情发生后,当地立即成立了防汛减灾指挥部,组织救灾人员到独龙江乡、捧当乡等重点乡镇开展抢险救灾工作,第一时间疏散转移安置群众482人,并加强各个地质隐患点巡查监控。目前,当地仍持续小雨天气,各项救灾工作正有序开展。</p><div class="img_wrapper"><img style="max-width: 500px;" src="http://n.sinaimg.cn/translate/20170603/j0cm-fyfvnky4316880.jpg" alt=""><span class="img_descr"></span></div><div class="img_wrapper"><img style="max-width: 500px;" src="http://n.sinaimg.cn/translate/20170603/hOKL-fyfvnky4316882.jpg" alt=""><span class="img_descr"></span></div><p>此外,据云南省气象台预报,今天至明天上午(6月4日08时),云南大部分地区仍将持续降雨天气,其中怒江、迪庆西部、保山北部、德宏有中到大雨局部暴雨。(央视记者 陈坚)</p>

  • 游客『zdhlp』于2017-6-3 20:09:23发表评论:
  • 评分: 3分
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  • 游客『txbfj』于2017-6-3 20:06:01发表评论:
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  • 游客『swaei』于2017-6-3 20:01:11发表评论:
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  • 游客『gkosw』于2017-6-3 19:55:30发表评论:
  • 评分: 3分
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